大肠菌群和粪大肠菌的检验
发布时间: 2013-03-24 浏览次数: 238

 

大肠菌群和粪大肠菌的检验

 

一、实验目的要求

1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。

2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。

二、原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括:大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染,同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g(或ml)检样内大肠菌群最近似数(the most probable number-简称MPN)表示。

三、试剂和仪器

(一)最先准备的器材

规格名称              数量          用途

1500ml广口瓶            1           稀释样品

2500ml三角瓶            2           制生理盐水

3250ml三角瓶            1           EMB琼脂

418×180mm试管         8           稀释及制双料乳糖胆盐发酵管

518×150mm试管         2025     单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管

613×130mm试管         20          制蛋白胨水、EC肉汤

71ml移液管              5

810ml移液管             3

9、直径为90mm平皿    12         制EMB平板

10250ml量筒             1

(二)应灭菌消毒的器材

剪刀1把、开瓶器、不锈钢药匙1把、滴管胶头4只、称量纸适量。

(三)应制备的培养基

培养基总量      所用容器

10.85%NaCl生理盐水           300ml         500ml三角瓶

2、乳糖胆盐发酵管                                             

双料:        10ml/      5   60ml     18×180mm试管(装有导管)

单料:        10ml/        8   90ml     18×150mm试管(装有导管)

3EMB琼脂:                  1   120ml    250ml三角瓶   

4、乳糖发酵管:    3ml/       5    20ml     13×130mm试管(装有导管)

5EC肉汤:       3ml/       6    20ml    13×130mm试管(装有导管)

6、蛋白胨水:      2ml/      10    20ml    13×130mm试管

四、实验内容

(第一天)样品处理及初发酵接种:

所需培养基与器材:

培养基:

1.0.85%NaCl生理盐水: 300ml       1

2.乳糖胆盐发酵管                                             

双料:      10ml/     35      18×180mm试管(有导管)

单料:      10ml/     68      18×150mm试管(有导管)

灭菌器材:

500ml广口瓶(内带5mm带玻璃珠)            12

18×180mm试管                             3

250ml量筒                                  1

1ml移液管                                  5

10ml移液管                                 3

当样品袋装样品时:消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只;当样品瓶装样品时:石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。

(一)、样品处理(无菌操作)

样品:瓶装饮料或酿造酒类:

用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌,用石炭酸纱布盖好,再用灭菌的开瓶器将盖打开,将含二氧化碳的样品倒入一信灭菌瓶内,加盖假盖,口勿盖紧,在其上覆盖在一块灭菌纱布,轻轻摇荡,待气体全部逸出后,妈样进行稀释。

 乳制品:

袋装奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口,以无菌操作取样,放入灭菌的三角瓶内,将225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入(先用少量生理盐水将奶粉调成糊状,再全部加入,以免结块)。

(二)、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验----[初发酵](无菌操作)

1、用无菌量筒量取225mL灭菌生理盐水倒入灭菌玻璃瓶内,用10ml移液管吸取9mL生理盐水注入无菌试管中,共2支,备用。 

2、以无菌操作将检样25mL(g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成110的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 00010000r/min的速度处理1min,做成110的均匀稀释液。

3、用10ml移液管吸取110的稀释液10ml分别注入双料乳糖胆盐发酵管中:共3支。

4、用1ml移液管吸取110的稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中:共3支。

5、用同上一支1mL灭菌吸管吸取110稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内,换一支吸管,吸吹5次,或振摇试管混匀,做成1100的稀释液。再用这支吸管吸取1100稀释液1mL分别注入单料乳糖胆盐发酵管中:共3支。

²    注意:做10倍递增稀释时,每递增稀释一次,要换用11mL灭菌吸管。

²    放入培养箱培养:

将接种后的乳糖胆盐发酵管置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产酸产气者(培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡),则按下列程序进行试验。

(第二天)进行EMB平板分离,[EC肉汤、蛋白胨水接种(粪大肠菌群检验)]:(无菌操作)

所需培养基与器材:

培养基:

1. EMB琼脂平板 5

2.EC肉汤:    5

3.蛋白胨水:   5

器材:

44.5±0.2水浴箱,接种环。

(一)、接种EMB平板进行分离培养

将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上(一管对一个平板),置36±1℃温箱内,培养1824h,然后取出,观察菌落形态,并挑取可疑菌落做:革兰氏染色和证实试验。

EMB平板上的典型菌落:呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选。

(二)、接种EC肉汤(用于粪大肠菌群检验)

用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内(一管对一个管),置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h。经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告:为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养1824h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。

(三)、接种蛋白胨水:(用于粪大肠菌群检验)

用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于蛋白胨水内(一管对一个管 ),置44.5±0.2水浴箱内,培养24±2h。同时取一蛋白胨水培养基不接种,一起培养做对照试验。

(第三天)进行乳糖发酵(证实试验)接种、镜检、靛基质试验、观察EC肉汤发酵结果。

所需培养基与器材:

培养基:

1.乳糖发酵管:5

2.靛基质试剂、(欧—波试剂)

3.革兰氏染色液

器材:显微镜

(一)、乳糖发酵接种

  在EMB平板上的典型菌落:呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选

EMB平板上,挑取可疑大肠菌群菌落12个同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。

(二)、进行镜检

EMB平板上,挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色。大肠菌群菌:革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。

(三)、进行靛基质试验

向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂(欧—波试剂)0.5mL,静置片刻,观察液面。阳性反应者,液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。则证实为粪大肠菌群阳性。

(四)、观察EC肉汤发酵结果

如所有EC肉汤管均不产气,则可报告:为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养1824h,凡平板上有典型菌落者,则证实:为粪大肠菌群阳性。

(第四天)观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗

(一)、观察乳糖发酵结果

观察:乳糖发酵管内是否有气体产生

凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

(二)、查表报告结果

  根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。

五、思考题      

1、大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管?

2、为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实?

3、复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需要加胆盐?

4、所有发酵管均为阴性反应时,检验结果可否报告为“零”?