典型案例1:鸡卵类粘蛋白的分离与纯化
发布时间: 2013-03-24 浏览次数: 241

 

 

  鸡卵类粘蛋白的分离与纯化

1实验目的要求

了解并熟悉鸡卵类粘蛋白的提取、分离、纯化的方法,掌握凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析、透析纯化等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白的原理及操作方法

2本实验所综合的学科知识点

本实验由多种实验内容与检测手段所组成,主要综合了以下知识点|

生物大分子的分离、提取(离心技术);      凝胶层析法分离鸡卵蛋白提取液;

离子交换柱层析纯化鸡卵类粘蛋白粗提液;..透析纯化的方法去除样品中盐类;

紫外分光光度法鉴定样品的含量及纯度。

内容涵盖了生物大分子的制备、分光谱层析透析等生化实验技术的内容;生物化学普通生物学有机化学无机化学等相关学科的知识,通过本实验培养学生对所学知识和实验技术的综合运用能力。

【操作方法】

一、鸡卵类粘蛋白的提取

1、取1个鸡蛋蛋清,量出体积,加入等体积的10pH 1.15三氯乙酸溶液,形成类似于酸奶状的白色沉淀,轻轻地搅拌均匀。在酸度计上检查最终pH值应为大约3.5pH值偏离3.5则要用5mol/L NaOH5mol/L HCl调节pH值,pH值调好稳定后室温静置4h 以上。

鸡卵类粘蛋白在10TCA溶液中有较好的溶解度,调pH3.5可使杂蛋白变性沉淀。

2、将烧杯中液体转入离心管中,配平,3000r/min离心10min 。收集上清液,再用滤纸过滤,以除去上清液中脂类物质及其它不溶物。滤液量体积,转入500 mL烧杯内,缓慢加入3倍体积冷丙酮,搅匀,用塑料薄膜封严,置冰箱放置2~4h

低温条件下,等电点沉淀与有机溶剂沉淀法配合使用,可达到最佳沉淀效果  

3、小心虹吸出部分上清液,剩余部分全部转移到50mL 带盖的离心管里,加盖经平衡后以3500r/min 离心10min,弃清夜,沉淀物放在真空干燥器内,抽气除去残留丙酮。使沉淀物由白转变为透明粘稠物后停止抽气。

4、加入20 mL蒸馏水溶解,若溶解液混浊则用滤纸滤去不溶物。滤液经Sephadex G-25柱层析法脱盐。

Sephadex G-25柱层析法脱盐的操作如下:

Sephadex G-25的处理  量取100mL Sephadex G-25,加入200mL磷酸盐缓冲液,沸水中1h。冷却后脱气。

5、装柱(25×300mm 用约2倍体积的0.02mol/L,pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可上样。

 

 

HD-1核酸蛋白检测仪操作

1)按要求连接所需配套仪器的连线。

2)打开记录仪“电源开关”,使“电源指示灯”亮。记录仪走纸速度3cm/h

3)将波长旋钮旋到所需波长刻度上,把“灵敏度”旋钮旋到“100%”档。

4)按下“电源”开关,“电源指示灯”亮,此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度,调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右,数字显示50左右。仪器开机稳定1h,待基线平直后,可加样测试。

5)开启柱口下夹子,使层析柱缓冲液流过检测仪(下端为进口)。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档,调节“光量”旋钮,使记录仪指针在10mV,检测仪数字显示为100,即透光率为100%。再把“灵敏度”开关旋到“0.5A”档,缓慢调节“调零”旋钮,使记录仪指针在“0位,检测仪数字显示为“0。以上步骤需反复调节几次,待层析系统平衡后,即可加样检测。

7、取20 mL蛋白粗提液上柱。控制流速15d/ min 待样品全部入床后,用同样的缓冲液洗脱,收集第Ι峰。即可得到脱盐的鸡卵类黏蛋白粗提取液。(凝胶层析法将溶液中分子大小不同的物质得到分离)

二、鸡卵类粘蛋白的纯化

通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白溶液仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同,采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。

1、量取 DEAE-纤维素粉(DE-3250ml,用100mL 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡20min 。用G3漏斗漏斗抽滤。用蒸馏水洗至pH 8.0 左右,抽干。然后移至500ml烧杯内,用150mlHCl溶液浸泡20min,再转移到G3漏斗漏斗内,抽滤,用蒸馏水洗至pH6.0左右,最后转移到烧杯内,用60mL mL 0.2mol/L,pH 6.5 磷酸盐缓冲液浸泡约15mim,经真空干燥器脱气后装柱。

2、装柱取一支层析柱(15×200mm),将处理过的DEAE-纤维素装入柱内。以同一种缓冲液平衡,流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。

3、上样吸附  将经Sephadex G-25脱盐后的鸡卵类黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol/LpH6.5的磷酸盐缓冲液平衡,洗去未被吸附的杂蛋白,直至基线稳定。     

 4、洗脱  改用含0.3mol/LNaCl0.02 mol/L, pH 6.5的磷酸盐缓冲液洗脱,收集鸡卵类粘蛋白的洗脱峰。量体积。

随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与吸附在离子交换剂上的蛋白质进行交换,而将蛋白质置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力弱的即等电点高的(pI4.9)先被洗下来,而与离子交换剂结合力强的即等电点低的(pI3.9~4.5)随后被洗脱下来,从而达到分离的目的,此时收集的即为较纯的鸡卵类粘蛋白)。

三、鸡卵类粘蛋白纯品的制备

1、透析  将层析收集的蛋白样品装入透析袋内,对蒸馏水进行透析,间隔1~2h更换一次蒸馏水,直至经1%AgNO3检查无氯离子为止(过夜)。

离子交换层析后必需脱盐,透析法是利用半透膜将大小不同的分子分开

2、量透析后蛋白样品体积,转移到烧杯内。取出1mL,稀释10倍,在紫外分光光度计上,280nm处测定鸡卵类粘蛋白的含量。剩余样品小心用1mol/LHCl调至pH4.0

蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413,据此可以测定其蛋白质的含量。

3、蛋白样品中加入3倍体积的冷丙酮(此时应出现大量沉淀,否则就是溶液pH值还不准确),用塑料薄膜封口,在冰箱静置4h

低温条件下,等电点沉淀与有机溶剂沉淀法结合使用,能达到最佳沉淀效果  

4、倾去上清,剩余浑浊液转移到50mL离心管内,于3500r/min 离心10min ,,收集沉淀,将沉淀抽真空干燥,即可得到透明胶状物-鸡卵类粘蛋白纯品