鸡卵类粘蛋白的分离与纯化
1、实验目的要求
了解并熟悉鸡卵类粘蛋白的提取、分离、纯化的方法,掌握凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析、透析纯化等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白的原理及操作方法。
2、本实验所综合的学科知识点
本实验由多种实验内容与检测手段所组成，主要综合了以下知识点|：
①生物大分子的分离、提取（离心技术）； ②凝胶层析法分离鸡卵蛋白提取液；
③离子交换柱层析法纯化鸡卵类粘蛋白粗提液；..④透析纯化的方法去除样品中盐类；
⑤紫外分光光度法鉴定样品的含量及纯度。
内容涵盖了生物大分子的制备、分离、光谱、层析、透析等生化实验技术的内容；生物化学、普通生物学、有机化学、无机化学等相关学科的知识，通过本实验培养学生对所学知识和实验技术的综合运用能力。
【操作方法】
一、鸡卵类粘蛋白的提取
1、取1个鸡蛋蛋清，量出体积，加入等体积的10％pH 1.15三氯乙酸溶液,形成类似于酸奶状的白色沉淀，轻轻地搅拌均匀。在酸度计上检查最终pH值应为大约3.5若pH值偏离3.5则要用5mol/L NaOH或5mol/L HCl调节pH值，pH值调好稳定后，室温静置4h 以上。
鸡卵类粘蛋白在10％TCA溶液中有较好的溶解度，调pH3.5可使杂蛋白变性沉淀。
2、将烧杯中液体转入离心管中，配平，3000r/min离心10min 。收集上清液，再用滤纸过滤，以除去上清液中脂类物质及其它不溶物。滤液量体积，转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置2~4h。
低温条件下，等电点沉淀与有机溶剂沉淀法配合使用，可达到最佳沉淀效果
3、小心虹吸出部分上清液，剩余部分全部转移到50mL 带盖的离心管里，加盖经平衡后以3500r/min 离心10min，弃清夜，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。使沉淀物由白转变为透明粘稠物后停止抽气。
4、加入20 mL蒸馏水溶解，若溶解液混浊则用滤纸滤去不溶物。滤液经Sephadex G-25柱层析法脱盐。
用Sephadex G-25柱层析法脱盐的操作如下：
Sephadex G-25的处理 量取100mL Sephadex G-25，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水中1h。冷却后脱气。
5、装柱（25×300mm） 用约2倍体积的0.02mol/L,pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可上样。
HD-1核酸蛋白检测仪操作
1）按要求连接所需配套仪器的连线。
2）打开记录仪“电源开关”，使“电源指示灯”亮。记录仪走纸速度3cm/h。
3）将波长旋钮旋到所需波长刻度上，把“灵敏度”旋钮旋到“100%”档。
4）按下“电源”开关，“电源指示灯”亮，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右，数字显示50左右。仪器开机稳定1h，待基线平直后，可加样测试。
5）开启柱口下夹子，使层析柱缓冲液流过检测仪（下端为进口）。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使记录仪指针在10mV，检测仪数字显示为100，即透光率为100%。再把“灵敏度”开关旋到“0.5A”档，缓慢调节“调零”旋钮，使记录仪指针在“0”位，检测仪数字显示为“0”。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。
7、取20 mL蛋白粗提液上柱。控制流速15d/ min， 待样品全部入床后，用同样的缓冲液洗脱，收集第Ι峰。即可得到脱盐的鸡卵类黏蛋白粗提取液。（凝胶层析法将溶液中分子大小不同的物质得到分离）
二、鸡卵类粘蛋白的纯化
通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白溶液仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同，采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。
1、量取 DEAE-纤维素粉（DE-32）50ml，用100mL 0.5 mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡20min 。用G3漏斗漏斗抽滤。用蒸馏水洗至pH 8.0 左右，抽干。然后移至500ml烧杯内，用150mlHCl溶液浸泡20min，再转移到G3漏斗漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用60mL mL 0.2mol/L,pH 6.5 磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，经真空干燥器脱气后装柱。
2、装柱、取一支层析柱（15×200mm），将处理过的DEAE-纤维素装入柱内。以同一种缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。
3、上样吸附 将经Sephadex G-25脱盐后的鸡卵类黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，洗去未被吸附的杂蛋白，直至基线稳定。
4、洗脱 改用含0.3mol/LNaCl的0.02 mol/L, pH 6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集鸡卵类粘蛋白的洗脱峰。量体积。
随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与吸附在离子交换剂上的蛋白质进行交换，而将蛋白质置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力弱的即等电点高的（pI4.9）先被洗下来，而与离子交换剂结合力强的即等电点低的（pI3.9~4.5）随后被洗脱下来，从而达到分离的目的，此时收集的即为较纯的鸡卵类粘蛋白）。
三、鸡卵类粘蛋白纯品的制备
1、透析 将层析收集的蛋白样品装入透析袋内，对蒸馏水进行透析，间隔1~2h更换一次蒸馏水，直至经1%AgNO3检查无氯离子为止（过夜）。
离子交换层析后必需脱盐，透析法是利用半透膜将大小不同的分子分开
2、量透析后蛋白样品体积，转移到烧杯内。取出1mL,稀释10倍，在紫外分光光度计上，280nm处测定鸡卵类粘蛋白的含量。剩余样品小心用1mol/LHCl调至pH4.0
蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413，据此可以测定其蛋白质的含量。
3、蛋白样品中加入3倍体积的冷丙酮（此时应出现大量沉淀，否则就是溶液pH值还不准确），用塑料薄膜封口，在冰箱静置4h。
低温条件下，等电点沉淀与有机溶剂沉淀法结合使用，能达到最佳沉淀效果
4、倾去上清，剩余浑浊液转移到50mL离心管内，于3500r/min 离心10min ,，收集沉淀，将沉淀抽真空干燥，即可得到透明胶状物－鸡卵类粘蛋白纯品。
