大肠菌群和粪大肠菌的检验
一、实验目的要求
1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。
二、原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。
三、试剂和仪器
（一）最先准备的器材
规格名称 数量 用途
1、500ml广口瓶 1个 稀释样品
2、500ml三角瓶 2个 制生理盐水
3、250ml三角瓶 1个 制EMB琼脂
4、18×180mm试管 8支 稀释及制双料乳糖胆盐发酵管
5、18×150mm试管 20～25支 单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管
6、13×130mm试管 20支 制蛋白胨水、EC肉汤
7、1ml移液管 5 支
8、10ml移液管 3 支
9、直径为90mm平皿 12套 制EMB平板
10、250ml量筒 1支
（二）应灭菌消毒的器材
剪刀1把、开瓶器、不锈钢药匙1把、滴管胶头4只、称量纸适量。
（三）应制备的培养基
培养基总量 所用容器
1、0.85%NaCl生理盐水 300ml 500ml三角瓶
2、乳糖胆盐发酵管
双料： 10ml/支 5支 60ml 18×180mm试管(装有导管)
单料： 10ml/ 8支 90ml 18×150mm试管(装有导管)
3、EMB琼脂： 1瓶 120ml 250ml三角瓶
4、乳糖发酵管： 3ml/支 5支 20ml 13×130mm试管(装有导管)
5、EC肉汤： 3ml/支 6支 20ml 13×130mm试管(装有导管)
6、蛋白胨水： 2ml/支 10支 20ml 13×130mm试管
四、实验内容
（第一天）样品处理及初发酵接种：
所需培养基与器材：
培养基：
1.0.85%NaCl生理盐水： 300ml 1瓶
2.乳糖胆盐发酵管
双料： 10ml/支 3～5支 18×180mm试管(有导管)
单料： 10ml/支 6～8支 18×150mm试管(有导管)
灭菌器材：
500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠） 1～2个
18×180mm试管 3支
250ml量筒 1支
1ml移液管 5 支
10ml移液管 3支
当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只；当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。
（一）、样品处理（无菌操作）
样品：瓶装饮料或酿造酒类：
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌的开瓶器将盖打开，将含二氧化碳的样品倒入一信灭菌瓶内，加盖假盖，口勿盖紧，在其上覆盖在一块灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，妈样进行稀释。
乳制品：
袋装奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口，以无菌操作取样，放入灭菌的三角瓶内，将225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先用少量生理盐水将奶粉调成糊状，再全部加入，以免结块）。
（二）、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验----[初发酵]（无菌操作）
1、用无菌量筒量取225mL灭菌生理盐水倒入灭菌玻璃瓶内，用10ml移液管吸取9mL生理盐水注入无菌试管中，共2支，备用。
2、以无菌操作将检样25mL(g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。
3、用10ml移液管吸取1：10的稀释液10ml分别注入双料乳糖胆盐发酵管中：共3支。
4、用1ml移液管吸取1∶10的稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。
5、用同上一支1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，换一支吸管，吸吹5次，或振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。再用这支吸管吸取1∶100稀释液1mL分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。
² 注意：做10倍递增稀释时，每递增稀释一次，要换用1支1mL灭菌吸管。
² 放入培养箱培养：
将接种后的乳糖胆盐发酵管置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产酸产气者（培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡），则按下列程序进行试验。
（第二天）进行EMB平板分离，[EC肉汤、蛋白胨水接种（粪大肠菌群检验）]：（无菌操作）
所需培养基与器材：
培养基：
1. EMB琼脂平板 5只
2.EC肉汤： 5支
3.蛋白胨水： 5支
器材：
44.5±0.2℃水浴箱，接种环。
（一）、接种EMB平板进行分离培养
将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上（一管对一个平板），置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并挑取可疑菌落做：革兰氏染色和证实试验。
在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。
（二）、接种EC肉汤（用于粪大肠菌群检验）
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内（一管对一个管），置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养24±2h。经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。
（三）、接种蛋白胨水：（用于粪大肠菌群检验）
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于蛋白胨水内（一管对一个管 ），置44.5±0.2℃水浴箱内，培养24±2h。同时取一蛋白胨水培养基不接种，一起培养做对照试验。
（第三天）进行乳糖发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验、观察EC肉汤发酵结果。
所需培养基与器材：
培养基：
1.乳糖发酵管：5支
2.靛基质试剂、（欧—波试剂）
3.革兰氏染色液
器材：显微镜
（一）、乳糖发酵接种
在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选
从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。
（二）、进行镜检
从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色。大肠菌群菌：革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。
（三）、进行靛基质试验
向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂（欧—波试剂）0.5mL，静置片刻，观察液面。阳性反应者，液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。则证实为粪大肠菌群阳性。
（四）、观察EC肉汤发酵结果
如所有EC肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实：为粪大肠菌群阳性。
（第四天）观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗
（一）、观察乳糖发酵结果
观察：乳糖发酵管内是否有气体产生
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
（二）、查表报告结果
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
五、思考题
1、大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？
2、为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？
3、复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需要加胆盐？
4、所有发酵管均为阴性反应时，检验结果可否报告为“零”？
