开 放 实 验 指 导 书  

 

        学 院 名 称            食品与生物工程学院

        课 程 名 称           活性天然产物筛选实验

        开课实验室               生物工程实验室

        执  笔  人                  刘 新 利

        审  定  人                  王    燕

        修（制）订日期          2009年1月12日 

 

 

《活性天然产物筛选实验》指导书

第一部分  实验安全常识

    微生物学实验是一门操作技能较强的课程，通过本课程学习要求学生牢固地建立无菌概念，掌握微生物实验的一套基本操作技术。树立严谨、求实的科学态度提高观察、分析问题和解决问题的能力；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风。

    为了提高教学效果保证实验的质量和实验室的安全，同学们须牢记如下注意事项：

    1．每次实验前必须充分预习实验教程以了解实验的目的、原理和方法。初步熟悉实验操作中的主要步骤和环节，使对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。

    2．非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品(包括帽子、围巾等)应放在不影响实验操作的地方。

    3．每次实验前须用湿布按净台面，必要时可用“洁尔灭”溶液擦拭（＜0.1％浓度)。实验前要洗手，以减少染菌的几率。

    4．微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作、防止杂菌污染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点：

    (1)在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流。

    (2)接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅，而导致杂菌污染。

    (3)已用过的带菌移掖管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5％石炭酸或其他消毒液中浸泡20 min，然后再取出,以免污染环境。

    (4)在清洗带菌的培养皿、三角烧瓶或试管等之前应先煮称半小时或进行加压蒸汽灭菌。

    (5)微生物学工作者在进行实验操作时应穿上工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。

    5．凡须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名(或组别)，放在指定的恒温培养箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果和按时交实验报告。

    6．实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舐标签、笔尖或手指等物以免感染。

    7．节约药品和水、电、汽等能源。

    8．各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置。

    9．实验完毕，立即关闭水电汽，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂洗手。值日生负责打扫实验室及进行安全检查(门窗、水、电、煤气等)。

    10．意外事故的处理：

    (1)如果玻璃器皿打碎而使菌液撒到桌面或地上时，应立即以5％石炭酸液或0.1％新洁尔灭溶液覆盖其上，半小时后再擦去。

    (9)如菌液污染手部时，应先用70％乙醇棉花拭去，再用肥皂水洗刷干净。如污染致病菌时，应将手浸于2-3％来苏尔或0.1％新洁尔灭溶液中。10——20 min后，再刷洗。

    (3)如不慎将菌液吸入口中，应立即吐出，并用大量自来水嗽口多次，再根据该菌的致病程度作进一步处置。

(4)如遇衣服或易燃品着火，应先断绝火源，再用湿布掩盖灭火，必要时及时用灭火器灭火。

 

第二部分  实验内容

（一） 实验目的

1、了解环境样本中特殊类群微生物的分离和纯种培养方法；

2、掌握微生物菌株的固态和液态发酵方法和产物的提取操作；

3、对菌株发酵产物的抑菌和抑制肿瘤细胞活性进行判定，筛选出可以产生活性物质的菌株。

（二） 实验原理

通过单菌落分离纯化的菌株进行纯种发酵，获得产物经致病指示菌或者体外抑瘤试验等方法进行高通量筛选出有生物学活性的物质。

（三） 实验材料和仪器

1、用具耗材：

酒精灯、打火机、接种针、接种环、接种铲、接种钩、镊子、搁架、无菌棉签、标签纸、记号笔、香柏油、二甲苯、擦镜纸、盖玻片、载玻片、草酸铵结晶紫、石炭酸番红、0.5%沙黄、碘液、5%孔雀绿水溶液、滤纸、药匙、棉花、绳子、pH试纸、牛皮纸、铁架台等。

2、玻璃器皿：

试管、培养皿、三角瓶、烧杯、量筒、漏斗、玻璃棒、玻璃珠、涂布棒、滴管、移液管、酸碱滴定管等。

3、仪器设备：

超净工作台、恒温培养箱、显微镜、目镜测微尺、照相机、水浴锅、高压灭菌锅、摇床、干燥箱、发酵罐、离心机、蠕动泵、色谱柱、紫外检测仪、记录仪等等。

4、试剂药品：

95%乙醇、色谱级甲醇、乙酸、蒸馏水、吸附树脂、色谱柱填料、牛肉膏蛋白胨培养基，LB培养基，马铃薯葡萄糖培养基（PDA），高氏1号培养基、稻瘟霉等致病指示菌、S180肿瘤细胞等。

（四） 实验步骤

1、专业相关文献资料检索技巧以及详细实验方案的设计

选择检索关键词、数据库；检索到的文献资料的整理和提炼；根据实验目的确定试验方案。

2、实验室准备工作

（1）仪器、设备、药品、试剂、器皿、用具的准备；

（2）玻璃器皿的清洗；

（3） 培养基配制与灭菌

3、自然界样本中微生物菌株的分离纯化

（1）特殊类群微生物的定向分离

根据待分离微生物的种群特征设计培养基和分离方法，如牛肉膏蛋白胨培养基，LB培养基，马铃薯葡萄糖培养基（PDA），高氏1号培养基等。

（2）分离菌株的纯化

平板划线法；稀释平板法；简易单孢子分离法；菌丝尖端分离法；菌落扩展膜边缘分离法；杂菌的抑制去除

（3）纯化后菌株的形态观察及种属鉴定

显微镜的操作方法，油镜下观察细胞形态，细胞的显微摄影技术，典型生理生化验证。

4、菌株的固态和液态发酵

固态发酵培养基的设计与配制，纯种操作技术，如斜面、平皿培养物的转接，以及固态培养物转接液体摇瓶进行发酵。

5、发酵产物的初步提取

（1）  弄清发酵产物的分离方法及原理；

（2）  独立设计分离实验方案；

（3）  掌握基本的分离操作技巧，独立评价实验结果。

6、抑菌活性筛选实验

掌握微生物产物抑菌的基本原理；掌握抑菌实验的基本操作方法，根据抑菌圈直径和抑菌谱判断微生物产物的抑菌活性。

7、抑制肿瘤活性筛选实验

了解微生物产物抑制肿瘤的原理，掌握抑瘤活性的体外筛选方法，如MTT法、罗丹明法等，掌握高通量筛选的概念以及数据处理的方法。

8、发酵条件的优化

在前期活性产物筛选的基础上，对选出的特定菌株进行发酵条件优化，学习优化实验设计技巧，数据处理，一些数学软件的使用方法。

（1）  部分因子析因实验设计

（2）  最陡爬坡实验设计

（3）  响应面法中心组合实验

9、产物的柱色谱分离纯化

了解柱色谱分离发酵产品的原料、工艺流程和操作方法；了解柱效的影响因素。

 

（五） 思考题

1、如何从自然界中得到可纯培养的菌株并进行种属鉴定？

2、如何通过实验判定发酵产物的抑菌、抑肿瘤活性？